细菌人工染色体微球技术在产前诊断中的应用

王燕、林元、黄海龙、林娜、王林铄、张敏、陈梅环、徐两蒲

摘要

目的

探讨细菌人工染色体微球（bacterial artificial chromosome on beads，BoBs）技术在产前诊断应用的可行性。

方法

选择2015年3月至2016年2月在福建省妇幼保健院产前诊断中心行羊膜腔穿刺术孕妇287例和行脐带穿刺术孕妇16例，行染色体核型分析同时采用BoBs技术检测染色体异常，并对BoBs提示染色体微重复和微缺失综合征加做基因芯片检测验证。

结果

BoBs技术检测出14例21–三体、5例18–三体、4例13–三体、1例48,XXYY和1例47,XXX，与染色体核型分析结果一致。BoBs技术同时检出3例22q11.2微缺失，1例22q11.2区域微重复，染色体核型分析结果显示无明显异常。进一步对1例22q11.2区域微重复和3例22q11.2微缺失行基因芯片检测，验证结果与BoBs检测结果一致。BoBs技术染色体异常检出率为9.57%（29/303），单纯染色体核型分析为8.25%（25/303）。15例高龄合并超声异常者的胎儿染色体异常检出率高达11/15。

结论

BoBs技术是一种用于检测染色体13、18、21、X、Y非整倍体异常和9种微缺失综合征的快速、可靠、易操作的方法，在产前诊断领域有广阔的应用前景。

【关键词】产前诊断；核型分析；染色体畸变；染色体缺失；染色体，人工，细菌

基金项目：福建省科技厅重大专项资助项目（2013YZ0002-1）；福建省临床重点专科建设资助项目（20121589）；福建省自然科学基金资助项目（2012J01311）；福建省卫生计生委中青年骨干人才培养资助项目（2013-ZQN-ZD-6）

我国新生儿出生缺陷中，30%是因染色体变异引起，常见染色体疾病包括21–三体、18–三体、13–三体、Klinefelter综合征等。传统的染色体核型分析技术具有周期长、耗时、耗力，且分辨率低等局限性。基于液相芯片技术开发的细菌人工染色体微球（bacterial artificial chromosome on beads，BoBs）技术是一种新的用于快速产前诊断的检测方法。本研究对303例孕妇的羊水和脐带血样本进行前瞻性研究，评估BoBs技术在产前诊断中的应用前景。

资料与方法

一、研究对象

选择2015年3月至2016年2月在福建省妇幼保健院产前诊断中心检查的303例孕妇，年龄19~42岁，其中单纯高龄101例、超声异常105例（主要包括胎儿颈项透明层厚度增厚、胎儿生长发育小于孕周、室间隔缺损、脉络丛囊肿等）、早或中孕期血清学筛查高风险76例、不良妊娠史（主要包括21–三体儿生育史和畸形儿生育史）6例，高龄合并超声异常15例。孕妇均签署产前诊断知情同意书及BoBs检测知情同意书，其中287例在孕18~24周+行羊膜腔穿刺术，16例在孕28+~31周+行脐带穿刺术。

二、方法

1.胎儿标本采集：287例孕妇接受B超引导下羊膜腔穿刺术，抽取羊水25~30 ml，其中20 ml用于细胞培养及染色体核型分析，另外5~10 ml用于产前BoBs检测。16例孕妇接受B超引导下脐带穿刺术，抽取脐带血5 ml，其中2.5 ml用于细胞培养及染色体核型分析，2.5 ml用于产前BoBs检测。

2.细胞培养及染色体核型分析：胎儿羊水细胞、脐带血细胞培养按本实验室常规方法完成，进行G显带染色体核型分析。诊断标准按照人类细胞遗传学国际命名标准2009（ISCN2009）。

3.产前BoBs检测：BoBs技术是一种液相芯片技术，共计83条细菌人工染色体探针，其中75条探针针对13、18、21、X、Y染色体及9种染色体微缺失综合征，每种目标疾病选择4~8条探针，另外8条探针为实验室质控探针。这些探针固定在已编码的微球（美国Luminex公司）上。标记有报告荧光的样本组DNA和标准DNA（美国Luminex公司）分别与微球上的探针进行杂交，通过检测杂交分子的荧光强度，分析出胎儿羊水细胞中染色体片段的缺失和重复。9种微缺失分别是猫叫综合征（Cri-du-Chat syndrome，CDC）、腭心面综合征（DiGeorge syndromeⅠ/Ⅱ，DGS/DIG）（DiGeorgeⅠ是22q11.2微缺失，DiGeorge Ⅱ是10p14微缺失，统称为DiGeorge 微缺失综合征）、毛发–鼻–指（趾）综合征（Langer-Giedion syndrome，LGS）、无脑回综合征（Miller-Dieker syndrome，MDS）、普瑞德-威利综合征（Prader-Willi syndrome，PWS）、史密斯–马吉利综合征（Smith-Magenis syndrome，SMS）、威廉姆斯综合征（Williams-Beuren syndrome，WBS）和Wolf-Hirschhorn综合征（Wolf- Hirschhorn syndrome，WHS）。

使用QIAamp DNA Blood Mini Kit（德国Qiagen公司）进行胎儿羊水细胞、脐带血细胞的基因组DNA提取，使用NanoDrop微量紫外分光光度计（美国Thermo Fisher公司）进行样本基因组DNA浓度、纯度的测量。使用染色体非整倍体和基因微缺失检测试剂盒（美国Perkin Elmer公司）检测染色体变异，按照操作手册完成检测。具体步骤为先将样本和参考DNA通过酶法标记生物素的核苷酸完成基因组DNA的标记，再采用纯化试剂盒将生物素标记的DNA纯化，然后将纯化好的DNA和BoBs混合物杂交过夜，之后进行DNA洗涤以及将微球与报告分子链霉亲和素–藻红蛋白孵育，从而使生物素标记的DNA与报告分子结合，最后进行洗涤微球和重悬后检测。对BoBs提示染色体微重复和微缺失综合征加做基因芯片检测验证。

4.基因芯片检测：选用美国Affymetrix Genome CytoScan 750K基因芯片，按照芯片操作手册进行DNA的消化、扩增、纯化、片段化、标记信号、杂交、洗片染色及扫描等步骤。拷贝数变异的报告阈值是缺失200 kb，重复500 kb，对数据分析和判断均采用Chromosome Analysis Suite（ChAS）软件。

结果

BoBs技术共检测303例DNA标本，其中287例来源于新鲜羊水、16例来源于新鲜脐带血，检测结果经过质量控制评估，全部样本检测合格，检测成功率为100%（303/303），异常检出率为9.57%（29/303）。其中共检测出14例21–三体，检出率为4.62%（14/303），见图1；5例18–三体，检出率为1.65%（5/303），见图2；4例13–三体，检出率为1.32%（4/303），见图3；1例48,XXYY，检出率为0.33%（1/303），见图4；1例47,XXX，检出率为0.33%（1/303），见图5。以上结果均与染色体核型分析结果一致。BoBs技术同时检测出3例22q11.2微缺失，检出率为0.99%（3/303），见图6；1例22q11.2区域微重复（Di George综合征），检出率为0.33%（1/303），见图7，经基因芯片验证确实存在22q11.2的微缺失和微重复，见图8~9。染色体核型分析结果显示无明显异常。

303例产前诊断标本中，不同DNA异常类型不同检测技术的检出情况见表1；送检原因和结果分析见表2。

讨论

一、产前BoBs技术较传统核型分析有明显优势

在胎儿染色体异常中，以21、18、13和性染色体数目异常最为常见[1-2]；在新生儿中，21–三体、18–三体、13–三体的发生率分别为1/1 200~1/650、1/2 000和1/5 000[3-4]，BoBs检测范围内9种微缺失的发生率为1/200 000~1/4 000[5-6]。传统核型分析是有创性产前诊断的金标准，但其检测周期长，对操作人员的技术水平要求高，因需进行细胞培养，会造成培养失败，此外该技术的检测分辨率低，常规中期染色体核型分析仅能检出10 Mb以上的变异，不能检测微小片段的缺失和重复。产前BoBs技术，通过微量DNA（240 ng）同时检测多种染色体异常，最常见的非整倍体包括13、18、21、X、Y染色体和人群中发生率较高的9种微缺失综合征（累计发生率可达到1/1 700）[7]。同时具有高通量的优势，一次性可以检测92个样本，在48 h之内完成，结果易于解读。

二、产前BoBs技术的临床验证已经较为深入

2011年，Gross等[8]进行了产前BoBs技术临床验证研究，收集了10例回顾性微缺失综合征标本以及104例前瞻性研究标本，回顾性标本全部检测成功，前瞻性研究标本检测成功率为97%，敏感度及特异度均为100%。同年，Vialard等[9]应用BoBs技术检测了616例DNA标本，经染色体核型分析比较发现BoBs技术成功率＞90%，并且具有较高的敏感度、特异度及准确度，嵌合比例＞20%时可被检测出，但BoBs不适用于三倍体的检测。

2012年，Vialard等[10]对5家欧洲产前诊断实验室1 653例产前诊断样本进行了分析，总体异常检出率为1/10，其中常见的非整倍体异常（21–三体所占比例最高，其次是18–三体）占到了被检测到的异常情况的85%，其假阳性率及假阴性率均低于1%。同年，周倩[11]利用产前BoBs技术对1例DiGeorgeⅠ微缺失综合征样本进行回顾性分析，得出与已知结果一致的结论。2015年，胡珺洁等[12]通过检测10例已知染色体非整倍体异常标本，以及对401例羊水样本进行前瞻性研究，指出BoBs技术是一种可选择的产前诊断新技术。

三、BoBs技术可在产前诊断中应用

本研究对287例羊水标本和16例脐带血标本进行前瞻性研究，所有有创性产前诊断的适应证（超声发现异常、孕妇高龄、血清学筛查高风险、不良妊娠史等）均包括在内。其中高龄合并超声异常的标本异常率高达11/15，提示这类孕妇是胎儿染色体异常的高发人群，在临床遗传咨询中应得到足够的重视。本研究总体异常检出率为9.6%（29/303），略低于文献[10]报道，最常见的非整倍体异常（21–三体所占比例最高，其次是18–三体）占检出的异常情况的86.2%（25/29），亦略低于文献[10]报道。本研究BoBs技术假阳性率及假阴性率均低于1%，与文献[10]报道一致。共检测出非整倍体异常25例，与染色体核型分析结果一致；检测出3例22q11.2微缺失综合征，1例22q11.2区域微重复。22q11.2区域微重复虽然不在BoBs检测范围之内，但是BoBs技术对其有一定的提示作用，以上微缺失和微重复均经基因芯片验证结果无误。对于DiGeorge-Ⅰ微缺失综合征致病性明确，但是22q11.2区域微重复样本芯片结果未见明确致病基因，胎儿预后不明确，可能无临床症状，也可能存在智力低下等异常[13-14]。将产前BoBs技术检测结果与染色体核型分析比较，其阳性率为9.6%（29/303），高于单纯染色体核型分析[8.3%（25/303）]，证实BoBs检测方法的确具有较高的敏感度、准确性及高效性，与文献[12]报道一致。

综上所述，BoBs技术作为一种液相芯片技术，具有对目标疾病诊断快速、灵敏、特异、信息量不大而易于解读、可避免检出临床意义不明确的变异等优点[15]。将产前BoBs技术结合传统的染色体核型分析应用于产前诊断，较染色体核型分析能够检测出常见的9种染色体微缺失综合征[16]，避免医疗纠纷；因BoBs检测周期短，可缓解孕妇及家属等待的心理负担，同时对探针覆盖区域内的其他染色体变异（如片段缺失或重复）具有一定的提示作用，经其他检测手段验证，将有助于进一步降低出生缺陷率。因此，BoBs在产前诊断中可发挥更大的作用，具有广阔的应用前景。固然，目前由于BoBs是一项新的技术，费用较高，影响了其推广。

作者：王燕林元等

来源：中华围产医学杂志

本文引用格式：王燕，林元，黄海龙，等.细菌人工染色体微球技术在产前诊断中的应用[J]. 中华围产医学杂志, 2017,20(2):125-131. DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2017.02.012

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