本文刊于：中华儿科杂志, 2018,56(4) : 310-312
作者：付晓婷 张琳
单位：河北医科大学第三医院儿科
人们一直认为"胎儿在宫腔内是无菌的"，肠道微生物初始化定植发生在分娩时及分娩后，阴道分娩儿初始定植菌主要源于母体如母亲的粪便、阴道和皮肤，主要为不动杆菌、双歧杆菌、葡萄球菌、普雷沃菌属和纤毛菌属；剖宫产儿则源于所接触的周围环境如手术环境、医疗器械及护理人员的手，主要为柠檬酸杆菌、大肠埃希菌、难辨梭菌、棒杆菌属和丙酸杆菌属。出生后肠道微生物群的演替主要受喂养方式、环境、药物等影响，1~3岁时形成近似成人相对稳定的微生物群结构。近年来研究者从胎粪、羊水和胎盘中分离出微生物DNA，提出"肠道微生物初始化程序性定植可能始于子宫"，来源于母体的口腔、肠道、胎盘和泌尿生殖道，并受孕期环境和疾病影响。现就近年来基于新生儿肠道微生物群的基础和临床研究，剖析肠道微生物起源和影响因素，探讨其定植、演替与婴儿远期疾病发生风险的关系。
一、新生儿肠道微生物起源假说
1．胎粪：
胎粪包含胎儿期吞咽的羊水、黏液、胎毛、胆汁、皮肤及消化道脱落的细胞。传统培养方法研究指出"胎粪不含微生物"，之后近一个世纪"宫腔内无菌"概念一直被人们所接受。Jiménez等[1]采用聚合酶链反应（PCR）技术从胎粪中检出葡萄球菌属和肠球菌属。随着二代基因测序技术的发展，研究者从早产儿胎粪中检测到细菌DNA，优势菌为乳杆菌属、葡萄球菌属、肠杆菌科，其多样性与孕周有关[2]。Moles等[3]认为早产儿胎粪与生后1周粪便微生物群结构存在差异，多样性低，优势菌为芽孢杆菌。足月儿胎粪微生物群不同于成人的粪便、皮肤和母亲阴道菌群，优势菌为乳酸菌或肠杆菌[4]，拟杆菌门较少。早产儿生命早期因其肠道环境的特殊性，易定植埃希菌属、志贺菌属和肠球菌属，拟杆菌属和双歧杆菌不丰富[5]，菌群多样性低，个体差异大[3]。
2．羊水：
既往研究认为羊水是"无菌"的，羊水中微生物侵袭与绒毛膜羊膜炎、早产、坏死性小肠结肠炎有关。在早产儿羊水中采用传统培养方法检测到解脲支原体、人型支原体、具核梭杆菌、阴道加德纳菌和拟杆菌，这些源于母亲的下生殖道或非泌尿生殖系统部位的低毒性微生物在子宫内激活了中性粒细胞，生成并释放促炎因子、前列腺素等，致宫颈成熟、胎膜早破，引发早产。但近期研究发现仅一小部分尿支原体属引发绒毛膜羊膜炎[6]，而且尿支原体感染是否得到治疗与妊娠结局无关。DiGiulio[7]发现早产儿完整羊膜和破裂胎膜羊水微生物是不同的，表现为拟杆菌门和厚壁菌门的比例不同，具有完整胎膜早产儿羊水中除了厚壁菌门、拟杆菌、放线菌和变形菌门外，还存在梭杆菌门，目前仍不清楚羊水中微生物的出现是否与早产有关。Ardissone等[2]研究发现胎粪与羊水中微生物物种存在重叠，认为可能与孕后期胎儿吞咽大量羊水，羊水中微生物传递至胎儿肠腔有关。
3．脐带：
23%的早产儿脐带血中存在解脲支原体和（或）人型支原体，可能与自发性早产、胎儿全身炎症反应综合征、支气管肺发育不良有关[8]。Jiménez等[9]从健康足月剖宫产儿脐血中分离出肠球菌、链球菌、葡萄球菌和丙酸菌属，认为与胎儿期微生物刺激与肠黏膜淋巴相关组织发育有关。
4．胎盘：
以往研究认为胎盘组织中细菌侵入与宫内感染、早产有关。Satokari等[10]从足月儿胎盘中发现双歧杆菌和乳酸杆菌DNA，丰度与分娩方式无关。Aagaard[11]采用全基因测序发现胎盘中存在独特微生物群如厚壁菌门、软壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门，其丰度低、代谢旺盛。足月儿胎盘中富含类芽孢杆菌，早产儿胎盘中富含伯克菌属，患有尿路感染孕妇胎盘中富含链球菌、不动杆菌，并认为可能与产前感染、早产有关[11]。"胎盘、羊水和胎粪中具有共同特征微生物群"这一现象提示新生儿可能在宫腔就暴露于微生物群[12]。
二、新生儿微生物来源的途经
一些研究提示新生儿第1次与微生物接触可能始于宫腔，但其起源和定植途径尚不清楚。宫腔内微生物来源有口腔-胎盘途径、消化道-胎盘途径和泌尿生殖道-胎盘途径。
1．口腔-胎盘途径：
口腔内富含多种微生物群，其中具核梭杆菌与牙周疾病有关，动物试验发现孕晚期母鼠感染具核梭杆菌会导致其早产及死产。有学者从早产儿胎盘、绒毛膜羊膜炎胎膜和羊水中也分离出具核梭杆菌，认为其能通过编码磷脂酶、脂多糖等毒力因子，表达多种表面黏附因子，为微生物侵入羊膜腔或胎盘提供可能，提示牙周疾病是促发早产的潜在危险因素[13]。口腔内非致病菌如内氏放线菌与低出生体重和早产有关，乳酸杆菌与高出生体重和过期产有关。多项研究发现，完整羊膜腔内羊水中微生物与口腔微生物种属有高度相似性[7]。Aagaard[11]发现胎盘微生物群与女性口腔微生物群结构近似，推测胎盘菌群可能源于孕妇口腔。
2．消化道-胎盘途径：
早期研究发现，新生儿胎粪中存在与母体粪便中相同的肠杆菌和双歧杆菌。Jiménez等[1]给孕母鼠经口灌注标记的屎肠球菌，并在新生小鼠肠腔中发现此菌,认为母孕晚期存在"肠道细菌移位"。临床研究发现，母孕期肠道微生物群发生巨大变化，直接影响新生儿胎粪中细菌含量和构成，提出"羊水中微生物来源于母体肠道"假设，机制可能是肠黏膜固有层树突细胞穿透肠道上皮，吞噬肠腔内微生物，并通过肠黏膜相关淋巴组织和（或）血液扩散至远端器官。
3．泌尿生殖道-胎盘途径：
孕母阴道中乳酸杆菌为优势菌[14]，胎儿娩出后其皮肤、口腔黏膜、鼻咽分泌物和胎粪中也检测出乳酸杆菌，推测"新生儿微生物来源于母亲阴道"。也有研究发现，与非妊娠女性阴道微生物群相比，妊娠女性阴道微生物群丰度低、多样性低，乳杆菌属较多，柔膜菌纲、脲原体较少，且不同于胎粪[15]，提示"胎粪中微生物可能不仅只源于母亲阴道"。
三、胎儿期免疫系统的发育
以往认为胎儿环境是无菌的，胎儿免疫系统是不成熟、不活跃的。近年来越来越多研究显示，母体肠道微生物群及其代谢产物可通过胎盘传递至宫腔内环境，暴露于胎儿，影响胎儿免疫系统的发育和成熟：一方面，母体微生物透过胎盘定植于胎儿淋巴结，调节CD4+CD25+FoxP3+T细胞，诱导胎儿对母体同种异型抗原的免疫耐受[16]；另一方面，宫腔内微生物通过与Toll样受体（TLR）作用，促进胎儿非特异性免疫的发育和成熟。研究发现，孕早期胎儿即有CD4+、CD8+T细胞表达，孕中期在胎儿小肠、肺、肝脏中高表达黏膜相关恒定T细胞[17]，产生γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素17 (IL-17)，识别细菌代谢产物，产生相应免疫应答。胎粪中所检测到的埃希菌属、明串珠菌属、肠球菌属、乳球菌属等是肠道初始定植菌，可刺激肠相关淋巴组织发育，为胎儿适应外界环境做准备。此外，母体肠道微生物群代谢产物如短链脂肪酸可通过胎盘中的单羧酸转运蛋白诱导产生肠道调节性T细胞[18]。宫内暴露于尿支原体能改变胎儿免疫环境，导致免疫失衡，其代谢产物直接影响胎儿器官发育或母胎面的炎症反应[19]，故宫腔内微生物结构失衡可导致不良妊娠结局如早产[2,3]。
四、影响新生儿肠道微生物起源的因素
1．饮食与抗生素：
母孕期均衡的膳食结构能降低早产发生风险[20]。动物试验显示，孕晚期母鼠高脂饮食可使子代肠道中拟杆菌属减少，影响其能量摄取和免疫发育[21]。孕母鼠无麸质饮食可增加子代肠道变形杆菌数量，减少促炎因子基因表达，降低子代远期胰腺炎和糖尿病发生风险[22]。Azad等[23]发现产时预防性应用抗生素可使子代肠道中肠球菌、梭菌属高表达，拟杆菌属低表达直至生后12个月。另有证据表明，孕中、晚期抗生素暴露可增加子代远期哮喘发生风险[24]。
2．疾病：
最新研究发现，母鼠孕期感染病毒通过激活异常免疫反应使其肠道微生物群构成和代谢发生变化，通过脑肠轴影响子代神经系统发育[25]。合并糖尿病孕母所生新生儿胎粪中拟杆菌属、卟啉单胞菌和毛螺旋菌科高于健康新生儿，且多样性高[26]。孕期体重增加过度产妇肠道中拟杆菌属和普氏菌属水平较高，双歧杆菌属水平较低，并影响子代肠道菌群的丰度和构成[27]。
3．孕龄：
孕妇肠道微生物群构成和丰度发生巨大变化，并与其胰岛素抵抗、促炎因子释放等代谢紊乱有关[28]。研究发现，足月阴道分娩儿肠道菌群主要为放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和少量厚壁菌门；早产阴道分娩儿主要为厚壁菌门、软壁菌门和少量放线菌门。因此，早产对其出生时肠道微生物群的构成是有影响的。
4．遗传背景：
宿主基因可影响其所寄生的微生物基因构成，如宿主人类白细胞抗原（HLA）基因与其粪便中拟杆菌属和普雷沃菌属丰度有关[29]。研究显示母孕期接触动物能降低TLR如TLR-2、TLR-4及CD14基因表达，是子代发生特应性皮炎的保护因素[30]。哮喘母鼠孕期接触鲁氏不动杆菌可降低子代气道高反应性[31]，机制是孕期微生物暴露可修饰免疫调节相关的表观基因并遗传给子代。
五、问题与展望
"胎儿宫腔内是否暴露于微生物"在学术上一直存在争议[32]：一是认为胎盘的机械屏障和免疫细胞、效应分子及抗菌肽构成的免疫屏障共同抵御外袭菌入侵，而且研究发现胎粪中微生物种的检出与胎膜破裂时间、胎粪排出时间存在关联[33]。新生儿生后肠道微生物的定植是迅速的，胎粪中所检测出的微生物并不代表胎儿宫内情况，胎盘、羊水中所检出的微生物不排除与孕期感染、妊娠合并症等有关。二是支持"宫内有菌"假说的研究大多基于16SrRNA技术，严格意义上不代表样本中存在活的微生物。另外，样本采集的方法和时间、保存方式及检测水平等对"低丰度、低多样性"微生物的检测存在极大影响，易受外界环境微生物的污染，而且许多研究设计中未设置空白对照。
总之，对"新生儿肠道微生物群起源假说"至今学者们仍存在争议，但大量的临床研究提示母孕期摄入益生菌如鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌、罗伊乳杆菌等能提高孕母固有免疫，减少孕期生殖系感染，降低妊娠期糖尿病、自发性早产、产后肥胖和远期子代特应性皮炎、湿疹的发生风险，但具体机制和菌株特异性有待进一步探索和临床验证。
参考文献（略）
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